Importanza del pretrattamento del campione
Il pretrattamento del campione è un passaggio lungo e soggetto a errori nell'analisi strumentale (in particolare nell'analisi cromatografica). La qualità del trattamento del campione influisce direttamente sul risultato finale dell'analisi cromatografica. Pertanto, al fine di migliorare l'efficienza dell'analisi e della determinazione, è importante migliorare e ottimizzare i metodi e le tecniche di preparazione del campione per l'analisi cromatografica. Poiché alcuni campioni appartengono a sistemi a matrice complessa, contenenti componenti quali proteine, oli, carboidrati, pigmenti, ecc., lo sfondo della matrice complessa causerà grossi problemi all'estrazione, separazione, purificazione e determinazione dei composti target da analizzare. Pertanto, il pretrattamento del campione non è solo complesso e difficile, ma ha anche un ruolo decisivo nell’accuratezza, affidabilità e sensibilità dei risultati dell’analisi.
Percentuale di consumo del tempo di pretrattamento del campione
Per gli strumenti LC/MS/MS altamente sensibili, un adeguato pretrattamento del campione è fondamentale per ridurre l'interferenza della matrice e arricchire i componenti.
Principi di pretrattamento del campione
Evitare cambiamenti chimici nei componenti durante la preparazione; prevenire ed evitare la contaminazione di componenti predeterminati; ridurre al minimo l'introduzione di composti irrilevanti nel processo di preparazione; e renderlo il più semplice e facile possibile.
Scopo del pretrattamento del campione
Rimuovere le particelle; ridurre le impurità interferenti; concentrare componenti in tracce; migliorare la sensibilità e la selettività del rilevamento; migliorare l'effetto di separazione; proteggere colonne e strumenti cromatografici; sostituzione del solvente.
Andamento dello sviluppo del pretrattamento del campione
▶Il pretrattamento comune dei campioni comprende: Metodo di digestione: un metodo per posizionare il campione con acido, ossidante, catalizzatore, ecc. in un dispositivo a riflusso o in un dispositivo chiuso, riscaldando, decomponendo e distruggendo la materia organica. Metodo di digestione umida
1. Metodo di digestione con acido nitrico (per campioni di soluzioni acquose più limpide) 2. Metodo di digestione con acido nitrico e acido perclorico (digestione di campioni contenenti materia organica difficile da ossidare) 3. Metodo di digestione con acido nitrico e acido solforico (acido nitrico: acido solforico=5:2, spesso aggiungendo una piccola quantità di perossido di idrogeno) 4. Metodo di digestione con acido solforico-acido fosforico (aiuta a eliminare l'interferenza degli ioni Fe3+ durante la determinazione) 5. Metodo di digestione con acido solforico e permanganato di potassio (comunemente utilizzato per determinare campioni di soluzioni acquose di mercurio) 6. Metodo di digestione con acido nitrico e perossido di idrogeno: alcune persone utilizzano questo metodo per digerire prodotti biologici per determinare azoto, fosforo, potassio, boro, arsenico, fluoro e altri elementi 7. Metodo di digestione multicomponente: è richiesto un sistema di digestione acida o ossidante a tre o più componenti. Metodo delle ceneri secche (metodo di decomposizione ad alta temperatura)
1. Il metodo delle ceneri non utilizza o utilizza una piccola quantità di reagenti chimici per decomporre i campioni e può gestire campioni di pesatura più grandi, quindi è utile migliorare l'accuratezza della determinazione degli oligoelementi. 2. La temperatura di incenerimento è generalmente di 450-550 gradi, che non è adatta per trattare campioni con componenti volatili, e anche il tempo di incenerimento è relativamente lungo. 3. A seconda del tipo di campione e delle proprietà dei componenti da misurare, vengono selezionati diversi crogioli e temperature di incenerimento. I crogioli comunemente usati sono quarzo, platino, argento, nichel, ferro, porcellana, politetrafluoroetilene e altre proprietà. Il principio è che il crogiolo non reagisce con il campione ed è stabile alla temperatura di lavorazione. 4. Di solito, non vengono aggiunti altri reagenti ai campioni biologici di incenerimento, ma per favorire la decomposizione e inibire la perdita per volatilizzazione di alcuni elementi, viene spesso aggiunta una quantità adeguata di agente di incenerimento ausiliario. Dopo che il campione è stato completamente incenerito, viene sciolto in acido nitrico o acido cloridrico diluito per l'analisi e la determinazione.
Conventional pretreatment methods Extraction and enrichment 1. Extraction method 1. Oscillation extraction method (vegetables, fruits, grains) 2. Tissue crushing extraction (extracting organic pollutants from animal and plant tissues) 3. Soxhlet extraction (commonly used to extract organic pollutants such as pesticides, petroleum, phenylhydrazine and pyrene from biological and soil samples) 2. Volatilization and evaporation concentration The volatile separation method uses the high volatility of certain components or converts the components to be measured into volatile substances, and then uses inert gas to take them out to achieve the purpose of separation. Evaporation concentration refers to heating the water sample on a hot plate or in a water bath to slowly evaporate the water, so as to reduce the volume of the water sample and concentrate the components to be measured. 3. Distillation method uses the different boiling points of the components of the water sample to separate them from each other; when determining volatile phenols, cyanides, and fluorides in water samples, they must first be pre-distilled and separated in an acidic medium; distillation has three functions: digestion, enrichment, and separation. 4. Ion exchange method uses ion exchangers to exchange reactions with ions in the solution for separation. Ion exchangers can be divided into inorganic ion exchangers and organic ion exchangers (ion exchange resins). ㈤ Coprecipitation method: The phenomenon that a poorly soluble compound in a solution carries out certain coexisting trace components in the process of forming a precipitate. The principle of coprecipitation is based on surface adsorption, the formation of mixed crystals, the interaction and inclusion of heteroelectron nuclei colloidal substances, etc. 1. Coprecipitation separation using adsorption: Common carriers include Fe (OH) 3, Al (OH) 3, Mn (OH) 2 and sulfides, etc. 2. Coprecipitation separation using the formation of mixed crystals 3. Coprecipitation separation using organic coprecipitants ㈥ Adsorption method: Use porous solid adsorbents to adsorb one or several components in the water sample on the surface to achieve the purpose of separation. Commonly used adsorbents include activated carbon, alumina, molecular sieves, large mesh resins, etc. The polluted components adsorbed and enriched on the surface of the adsorbent can be desorbed by organic solvents or heated for determination. ㈦ Chromatography Chromatography is divided into column chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography, etc., and adsorbents are divided into inorganic adsorbents and organic adsorbents. ㈧ Sulfonation and saponification Sulfonation: The interfering substances such as fats and waxes in the extract can undergo sulfonation reaction with concentrated sulfuric acid to generate highly polar sulfonic acid compounds, which are separated from the pesticides in the extract as the sulfuric acid layer separates. The sulfonation method uses the saponification reaction of oils and fats with strong alkali to generate fatty acid salts and separate them. ㈨ Low-temperature freezing method is based on the principle that the solubility of different substances in the same solvent varies with temperature to separate them from each other. ㈩ Principle of extraction: The distribution coefficient of substances in different solvent phases is different, so as to achieve the separation and enrichment of components. Types of conventional liquid-liquid extraction Extraction of organic substances: Organic substances separated in the aqueous phase are easily extracted by organic solvents Extraction of inorganic substances: First, a reagent is added to combine with the ionic components in the aqueous phase to generate a substance that is uncharged and easily soluble in organic solvents. The reagent, organic phase, and aqueous phase together form an extraction system. According to the different types of extractables generated, it can be divided into chelate extraction system, ion-association complex extraction system, ternary complex extraction system, and synergistic extraction system. Overview of solid phase extraction (SPE) It is developed by combining liquid-solid extraction and column liquid chromatography technology. SPE is a column chromatography separation process, which has many similarities with high performance liquid chromatography (HLPC) in terms of separation mechanism, stationary phase and solvent selection. The particle size of SPE filler (>40μm) è maggiore di quello dell'HLPC (3-10μm). Pertanto, la SPE può essere utilizzata solo per separare composti con proprietà di ritenzione molto diverse. La tecnologia SPE con bassa efficienza di separazione viene utilizzata principalmente per trattare i campioni. Lo scopo della SPE è quello di rimuovere dal campione le sostanze che interferiscono con le successive analisi; arricchire i componenti in tracce e migliorare la sensibilità analitica; cambiare il solvente del campione per adattarlo al metodo analitico; derivatizzazione in situ; dissalazione del campione; e facilitare la conservazione e il trasporto dei campioni. Installazione colonna SPE: la dimensione delle particelle del riempitivo è diversa dal riempitivo della colonna HLPC e il resto è lo stesso. La più utilizzata è la fase C18. Questo tipo di riempitivo è altamente idrofobo e mostra ritenzione per la maggior parte della materia organica nella fase acquosa; vengono utilizzati anche altri materiali con diverse proprietà di selettività e ritenzione. Le fasi SPE con gruppi attivi o rivestite con composti attivi possono essere utilizzate per analizzare le reazioni di derivatizzazione. Disco SPE: molto simile ai filtri a membrana. Il disco estrattore è un disco di PTFE contenente riempitivo oppure un foglio di fibra di vetro caricato con riempitivo; il riempitivo rappresenta circa dal 60% al 90% del disco SPE totale e lo spessore del disco è di circa 1 mm. La differenza rispetto al primo è il rapporto spessore/diametro del letto (L/d). Adatto per arricchire le tracce di inquinanti dell'acqua. Microestrazione in fase solida (SPME) SPE offline e online SPE offline 1. La SPE e l'analisi vengono eseguite in modo indipendente e SPE fornisce solo campioni idonei per le analisi successive. 2. Per garantire un contatto sufficiente tra la soluzione campione e il riempitivo, il flusso del solvente non può essere troppo elevato. 3. Può essere completato con strumenti automatizzati. Lo strumento SPE automatico è costituito da un rack per colonne, una pompa a stantuffo, un serbatoio di liquido, una tubazione e un processore di campioni. La SPE online è anche nota come tecnologia di purificazione e arricchimento online, utilizzata principalmente per stabilire il metodo SPE di analisi HLPC Scopo del pretrattamento della colonna: 1. Rimuovere le impurità che possono esistere nel riempitivo; 2. Solventizzare il riempitivo e migliorare la riproducibilità dell'estrazione in fase solida Aggiunta del campione 1. Per evitare la perdita di analiti, la concentrazione del solvente nel campione non deve essere troppo elevata; 2. Quando si estrae con la meccanica a fase inversa, come solvente viene utilizzato acqua o tampone e la quantità di solvente organico non supera il 10% (V/V); 3. Per superare la perdita di analiti durante l'aggiunta del campione, è possibile utilizzare solventi deboli per diluire il campione, ridurre il volume del campione, aumentare la quantità di riempitivo nella colonna SPE e selezionare adsorbenti che abbiano una forte ritenzione dell'analita. Eluizione e raccolta degli analiti (un altro caso è che le impurità vengono trattenute mentre gli analiti passano attraverso la colonna) (Estrazione in fase solida con mezzi di dispersione solidi) 1. Per le colonne di estrazione in fase inversa, il solvente detergente è acqua o tampone contenente una concentrazione adeguata di sostanze organiche solvente; 2. Per determinare la concentrazione e il volume ottimali del solvente detergente, aggiungere il campione alla colonna SPE, pulirlo con un volume da 5 a 10 volte superiore al letto della colonna SPE, raccogliere e analizzare a turno l'effluente e ottenere il profilo di eluizione del solvente detergente per l'analita. Aumentare a sua volta la concentrazione del solvente detergente e determinare la concentrazione e il volume appropriati del solvente detergente in base al profilo di eluizione dell'analita a diverse concentrazioni; 3. Scopo dell'eluizione e della raccolta: eluire completamente l'analita e raccoglierlo nella frazione di volume più piccola, trattenendo il maggior numero possibile di impurità che sono trattenute più fortemente dell'analita sulla colonna SPE; 4. Per aumentare la concentrazione dell'analita o regolare le proprietà del solvente per le analisi successive, la frazione di analita raccolta può essere essiccata con azoto e quindi sciolta in un piccolo volume di solvente. Applicazione dell'analisi ambientale SPE 1. La concentrazione di analiti nei campioni ambientali come l'acqua superficiale è molto bassa e l'analita deve essere arricchito prima dell'analisi. 2. La composizione dei fluidi biologici è complessa e contiene una grande quantità di proteine. Prima dell'analisi, il campione deve essere pretrattato per rimuovere la proteina. Analisi di farmaci Analisi clinica Analisi di alimenti e bevande Microestrazione in fase solida (SPME) La microestrazione in fase solida integra "campionamento, estrazione, concentrazione e iniezione" e può essere utilizzata insieme alla gascromatografia o alla cromatografia liquida ad alte prestazioni per la tecnologia di pretrattamento dei campioni. Teoria della microestrazione in fase solida Teoria dell'equilibrio: durante il processo di adsorbimento, viene stabilito un equilibrio di adsorbimento tra la fase solida e quella liquida o gassosa. Entro un certo periodo di tempo, a causa del lento processo di trasferimento di massa, l’equilibrio non viene raggiunto completamente. La selettività dell'estrazione del materiale di rivestimento dipende principalmente dalle prestazioni del materiale di rivestimento. Secondo il principio secondo cui l'analita viene facilmente estratto da una fase solida con polarità simile, viene selezionato un rivestimento SPE adatto. Le sostanze più comunemente utilizzate per i rivestimenti in fase solida sono il polimetilsilossano (PDMS) e il poliacrilato (PA), entrambi utilizzabili per la gascromatografia e la cromatografia liquida. Il primo è utilizzato principalmente per composti non polari come composti volatili, idrocarburi policiclici aromatici e idrocarburi aromatici, mentre il secondo è utilizzato principalmente per composti polari come triazine e composti fenolici. Lo strato di fase solida può essere rivestito sulla fibra di quarzo in una forma non legata, legata o parzialmente reticolata. L'aggiunta di alcuni polimeri al rivestimento può aumentare la superficie del rivestimento e migliorare l'efficienza dell'SPME. 1. Polidimetilsilossano-divinilbenzene (PDMS-DVB), utilizzato per idrocarburi aromatici e composti volatili. 2. Polietilenglicole-divinilbenzene (CW-DVB), utilizzato per composti polari come gli alcoli. 3. Resina modello glicole polietilenico (CW-TPR), utilizzata per tensioattivi ionizzati 4. Fibra di quarzo rivestita con nerofumo di grafite, utilizzata per analizzare tracce di inquinanti nell'acqua e nell'aria. 5. Creazione di metodi con nanotubi di carbonio e nanotubi di biossido di titanio 1. Mantenere la coerenza delle condizioni di campionamento. 2. I fattori che influenzano il campionamento includono il tempo di campionamento, la temperatura, la profondità delle fibre, ecc. 3. Mantenere una relazione lineare tra il valore di risposta e la concentrazione iniziale dell'analita. La concentrazione del campione non può essere troppo elevata e il volume del campione non può essere troppo piccolo, in modo che l'estrazione avvenga nell'intervallo lineare dell'isoterma di adsorbimento. 4. L'aggiunta di elettroliti al campione può aumentare la forza ionica della soluzione, riducendo così la solubilità dell'analita e migliorando l'efficienza di estrazione; la modifica del pH del campione ha un effetto maggiore sulla velocità di estrazione delle sostanze acide e alcaline. Nota: l'effetto dell'aggiunta di sale nella microestrazione è talvolta diverso da quello dell'estrazione liquido-liquido convenzionale e le condizioni sperimentali devono essere ottimizzate. 5. L'agitazione può ridurre il tempo di estrazione. Estrazione a microonde (MAE) L'estrazione a microonde ha tempi di estrazione brevi, buona selettività, alto tasso di recupero, basso utilizzo di reagenti, basso inquinamento, può utilizzare acqua come estraente e può controllare automaticamente le condizioni di preparazione del campione; ha meno applicazioni ed è attualmente utilizzato nell'estrazione di idrocarburi policiclici aromatici, residui di pesticidi, composti organometallici, principi attivi nelle piante, sostanze nocive, metalli nei minerali, farmaci nel sangue e residui di pesticidi nei campioni biologici. Principi e caratteristiche dei metodi di estrazione a microonde Assorbono le microonde (acqua, etanolo, acidi, alcali e sali) Alta efficienza di estrazione a microonde: 1. Azione diretta delle microonde sulle sostanze separate; 2. È più vantaggioso utilizzare solventi polari rispetto a solventi non polari per l'estrazione a microonde; 3. L'uso di contenitori chiusi consente di effettuare l'estrazione a microonde ad una temperatura molto più alta del punto di ebollizione del solvente, migliorando notevolmente l'efficienza dell'estrazione a microonde Microonde riflesse (sostanze metalliche) Microonde trasmittenti (sostanze non polari) Estrazione a microonde attrezzature e metodi (i componenti principali sono dispositivi di riscaldamento a microonde appositamente realizzati, contenitori di estrazione e dispositivi di controllo della pressione e della temperatura equipaggiati in base ai diversi requisiti) Multi-cavità 2450 MHz: è possibile preparare più campioni contemporaneamente, è facile controllare le condizioni di estrazione e l'estrazione è veloce. Metodo di estrazione a microonde convenzionale: mescolare solventi polari o una miscela di solventi polari e solventi non polari con i campioni estratti, inserirli in contenitori per la preparazione dei campioni a microonde e riscaldarli in un sistema di preparazione dei campioni a microonde in uno stato chiuso. Controllare la pressione o la temperatura e il tempo di estrazione in base alle esigenze dei componenti estratti; al termine del riscaldamento filtrare il campione e il filtrato viene misurato direttamente oppure misurato dopo corrispondente trattamento. In circostanze normali, il tempo di riscaldamento dell'estrazione a microonde è di circa 5-10 minuti. Il volume totale del solvente di estrazione e del campione non deve superare 1/3 del volume della coppa per la preparazione del campione. Messa a fuoco monomodale 2450 MHz: non è richiesto alcun controllo della pressione e della temperatura, il volume di preparazione del campione è ampio, è possibile preparare un solo campione alla volta e il tempo di estrazione è lungo. Estrazione con fluido supercritico (SCF)
Il fluido supercritico (SCF) è un fluido la cui temperatura e pressione sono entrambe superiori al punto critico. Le sue caratteristiche sono: 1. Il suo coefficiente di diffusione è inferiore a quello del gas, ma un ordine di grandezza superiore a quello del liquido; 2. La sua viscosità è vicina a quella del gas; 3. La sua densità è simile a quella del liquido e un leggero cambiamento di pressione può portare a un cambiamento significativo nella sua densità; 4. I cambiamenti di pressione o temperatura possono portare a cambiamenti di fase. Principio di base Nello stato supercritico, il fluido supercritico viene a contatto con la sostanza da separare, in modo che possa estrarre selettivamente i componenti di polarità, punto di ebollizione e massa molecolare relativa, e la densità e la costante dielettrica del fluido supercritico aumentano con l'aumento della pressione del sistema chiuso, la polarità aumenta. I componenti di diverse polarità possono essere estratti passo dopo passo utilizzando il potenziamento del programma. La solubilità della CO2 supercritica: 1. I componenti lipofili e bassobollenti possono essere estratti a bassa pressione (104kPa); 2. Più gruppi polari ha un composto, più difficile è estrarlo; 3. Maggiore è la massa molecolare relativa del composto, più difficile sarà l'estrazione. Il modificatore CO2 è un solvente non polare e generalmente viene aggiunto un solvente polare per migliorarne la solubilità in CO2, quindi è chiamato modificatore. Quelli più comunemente usati sono metanolo, acetone, etanolo, acetato di etile, ecc. L'effetto del modificatore è limitato. Oltre a modificare la solubilità del fluido supercritico, ciò indebolirà anche l'effetto di cattura del sistema di estrazione, con conseguente aumento dei coestratti, che potrebbero interferire con la determinazione analitica. La quantità di modificatore utilizzata dovrebbe essere piccola, generalmente non superiore al 5%. L'applicazione della tecnologia di estrazione del fluido supercritico presenta grandi vantaggi nell'estrazione di sostanze naturali; può essere utilizzato insieme a GC, IR, MS, LC, ecc. per diventare un metodo analitico efficiente.
